许多疾病并不是因为某个卵白富余坏掉，而是因为基因在失实的时辰、失实的细胞里被灵通或关闭。问题是：咱们怎样知谈这些“开关”是谁按下的？

6月4日，发表在《Cell》的研究报谈“Single-cell mapping of regulatory DNA-protein interactions” 给出了一种新的不雅察阵势。研究东谈主员建造了 D&D-seq，即“锚定与脱氨后测序”（docking and deamination followed by sequencing）。它不再只看染色质是否开放，也不单意象转录因子（transcription factor， TF）可能结合在那里，而是尝试在单个细胞中径直纪录 DNA-卵白相互作用（DNA-protein interaction）。这项责任果真好得热心的场地，不仅仅“又多了一种单细胞时期”，而是它把基因调控研究里一个永远艰苦推到了显微镜下：那些弱的、一忽儿的、容易被传统措施漏掉的结合事件，是否也能被捕捉？

昔时咱们频频看到“门开了”，却不知谈谁进来了

在基因调控研究中，ATAC-seq 能告诉咱们染色质哪些区域是开放的；ChIP-seq 和 CUT&Tag 能定位卵白与 DNA 的结合。但这些措施齐有范畴。

开放染色质（open chromatin）像是一扇门开着，但门开着并不代表某个特定转录因子一定进来了。相悖，转录因子结合基序（motif）也不够可靠。论文提到，东谈主类约有 1100 个转录因子已有 DNA 结合基序信息，但基序自身时常不及以准确研究体内真实结合。更复杂的是，跨越 90% 的全基因组关联研究（genome-wide association study， GWAS）信号位于非编码区，这些区域很可能通过调控元件影响疾病风险。

这意味着，咱们需要知谈的不仅仅“序列上有莫得座位”，而是“某个细胞里，某个卵白是否真的坐在了那里”。

传统 CUT&Tag 类措施依赖 Tn5 转座酶在抗体定位处切割并加商议，但 Tn5 自身容易径直结合开放 DNA，因此需要 300–500 mM NaCl等较高盐条款来压低配景。问题随之而来：高盐条款可能禁锢弱结合，也可能影响低亲和力抗体的靶向材干。关于转录因子这类频频一忽儿停留的调控卵白，这少许尤其庇荫。

D&D-seq 的念念路：不切 DNA，而是在摆布留住一个“碱基面迹”

D&D-seq 的假想很奥密：研究东谈主员把抗体识别系统和碱基裁剪酶（base editor）纠合起来。具体来说，他们将双链 DNA 脱氨酶 DddA 与纳米抗体（nanobody）会通，让它通过抗体蚁共策动卵白结合的 DNA 区域。随后 DddA 将隔邻 DNA 上的胞嘧啶（cytosine， C）支柱为尿嘧啶（uracil， U）；测序时，这类事件进展为 C>T或互补链上的G>A信号。

这与“切割 DNA”不同。D&D-seq 更像是在卵白停留过的位置隔邻留住一个可读出的碱基面迹。研究东谈主员还接纳了分裂式 DddA11 假想：N 端 DddA 与纳米抗体会通，唯有加入 C 端小肽和 Zn²⁺ 后才规复催化活性。这么不错缩小游离酶飞快搏斗 DNA 形成的非特异脱氨。

在 K562 细胞中，研究东谈主员最初测试了 CTCF、GATA1 和 GATA2。废除判辨，在对应 ENCODE ChIP-seq 峰隔邻，D&D-seq 读段中 C>T 或 G>A 变化显耀增多；在围绕 CTCF、GATA1、GATA2 结合位点 ±100 bp 的 200 bp 窗口内，不错看到典型的双峰式“分子脚迹”（molecular footprint）。更要津的是，CTCF 和 GATA 联系基序在 D&D 阳性峰中排行靠前，证据这些裁剪并不是飞快噪声，而是与策动卵白结合位置相吻合。

它不单看开放染色质：CTCF 在“关闭区域”也被看见了

要是一种措施只可在开放染色质中责任，它对基因组调控的涌现仍然会偏向“依然灵通的区域”。因此，研究东谈主员进一步将 D&D-seq 与全基因组测序（whole-genome sequencing， WGS）结合，检测 CTCF 在非开放染色质中的结合。

废除很迥殊念念：他们在开放染色质区域以外识别出 2045 个 CTCF 结合峰，其中196 个不可及峰与 H3K9me3 或 H3K27me3 等异染色质标记近似。

这证据 D&D-seq 不仅仅 ATAC-seq 的从属读数，而有后劲不雅察传统开放染色质措施难以诡秘的卵白结合事件。关于 CTCF 这么同期参与转录调控和三维基因组结构的因子，这少许尤其垂危。

研究东谈主员还测试了 p300。p300 是组卵白乙酰调动酶（histone acetyltransferase），平庸通过共激活因子被招募到增强子隔邻，并不径直依靠一个固定 DNA 基序结合。D&D-seq 在 p300 ChIP 界说区域隔邻捕捉到更宽的脱氨脚迹，这得当染色质重塑复合物占据限度更弥漫的特色。其高裁剪峰富集了 GATA、NF-Y、KLF1 等与 p300 相互作用联系的转录因子家眷基序。换言之，这种措施不仅能看“有明确座位号”的转录因子，也能看一些更依赖卵白复合物招募的调控因子。

单细胞考证：混在沿路的细胞，信号莫得串台

果真的磨砺是单细胞场景。研究东谈主员将 D&D-seq 接入 10× Genomics 单细胞 ATAC-seq（scATAC-seq）经过，滚球app中国官网下载入口并作念了一个细胞搀杂施行：CA46 淋巴细胞系用 CTCF 抗体染色，K562 红系样细胞系用 GATA1 抗体染色，然后搀杂惩处。

最终数据包含 4108 个 CA46 细胞和1732 个 K562 细胞。两类细胞的 ATAC 质地周边：K562 平均每细胞5263±2633 个片断，CA46 为5437±2588 个片断。更垂危的是，CTCF 裁剪信号主要出咫尺 CA46 细胞中，GATA1 裁剪信号主要出咫尺 K562 细胞中；非靶向细胞中莫得相应结合信号。这证据在液滴封装、条形码标记和建库过程中，D&D 信号莫得彰着跨细胞沾污。

在性能比较中，D&D-seq 的特异性也很超越。以 CTCF 为例，研究东谈主员将 CA46 单细胞下采样到 5000、500、50 和 10 个细胞，策动落在 ChIP-seq 峰内的读段比例（fraction of reads in peaks， FRiP）。

scD&D-seq 的 FRiP 辞别为 56.75%、56.78%、56.83% 和 57.00%，简直不随细胞数下落而衰减。比拟之下，uliCUT&RUN 在调换细胞数下辞别为13.69%、13.69%、13.89% 和 14.04%。

在另一组比较中，CTCF scD&D-seq 的中位 FRiP 为 0.57，GATA1 为0.43，而 Olig2 scCUT&Tag 的中位 FRiP 约为0.22。

这些数字不应被浅易涌现为“某措施全面胜出”，因为靶标、抗体、细胞类型和分析计谋齐可能影响废除。但它们至少支撑一个判断：D&D-seq 对策动卵白结合位点的富集材干较强，尤其得当在低输入或单细胞团员分析中提真金不怕火转录因子结合信号。

在真实东谈主类样本中，CTCF 信号能纠合三维基因组

细胞系考证之后，滚球app研究东谈主员将 D&D-seq 讹诈于健康供者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells， PBMCs），靶向 CTCF。数据包含 5358 个高质地单细胞，平均每细胞15534±5934 个片断。基于染色质可及性，研究东谈主员识别出造血干/祖细胞（hematopoietic stem/progenitor cell， HSPC）、单核细胞、旧例树突状细胞（conventional dendritic cell， cDC）、当然杀伤细胞（natural killer cell， NK）、B 细胞、CD8 T 细胞和 CD4 T 细胞等主要群体。

接下来，研究东谈主员把消失批细胞中的 scATAC-seq 信息和 CTCF D&D-seq 信息输入 C.Origami，用于研究三维染色质结构。以 CD8 T 细胞为例，研究得到的搏斗矩阵与公开 Hi-C 数据在合座形态上相似，并能规复短程和长程染色质互作。研究东谈主员还在 100 个飞快采选的 2 Mb 基因组区域中比较研究进展，发现使用 D&D-seq CTCF 输入的废除与使用 CTCF ChIP-seq 输入的废除周边，而去掉 CTCF 信息的进展较差。

这里需要严慎：这不是径直测量 Hi-C，而是模子研究。因此它更得当被涌现为“D&D-seq 提供的信息足以匡助重建三维结构思绪”，而不是“单细胞中径直测到了完好三维基因组”。

IDH2 突变的 T 细胞：一个突变如何侵扰基因组范畴？

该研究中最有生物学张力的部分，是 D&D-seq 与单细胞基因分型结合。研究东谈主员分析了一例兴味未明克隆性造血（clonal hematopoiesis of indeterminate potential， CHIP）样本，该样本带有 IDH2R140Q 突变，靶向测序检测到的变异等位基因频率（variant allele frequency， VAF）为 0.15。

通过 D&D-GoT-ChA 经过，研究东谈主员在消失个细胞中同期读取基因型、染色质可及性和 CTCF 结合。两次时期重复合并后得到 15807 个细胞，平均每细胞7592±3971 个片断。其中5291 个细胞成功分型，占 33%；分型废除包括4177 个 IDH2 野生型细胞和1114 个 IDH2 突变细胞。

最值得防卫的是，IDH2 突变细胞在 CD8 T 细胞中彰着富集。单细胞数据判辨，CD8 T 细胞中突变比例为 34.6%，而 B 细胞、CD4 T 细胞、单核细胞和 NK 细胞中的比例辞别约为2.8%、2.4%、3.0% 和 2.9%。研究东谈主员进一步用分选细胞的 bulk 纳米孔测序考证，CD8 T 细胞中的 IDH2 VAF 为19.8%，彰着高于其他细胞群。

随后，研究东谈主员识别出 5631 个 CTCF 阳性峰，并比较 IDH2 野生型与突变型 CD8 T 细胞的 CTCF 结合。由于 ATAC 片断数会影响可检测裁剪数，研究东谈主员先牵记掉总 ATAC 片断数的影响。翻新后，野生型细胞的 D&D 裁剪信号显耀高于突变细胞；多半各异 CTCF 位点在突变细胞中结合下落。

这与 IDH 突变的已知机制相吻合：IDH 突变可导致 2-羟基戊二酸（2-hydroxyglutarate， 2-HG）升高，烦躁 TET 家眷介导的 DNA 去甲基化；而 CTCF 结合位点甲基化升高可能减轻 CTCF 结合。论文的数据领导，在真实东谈主类 CHIP 样本中，这一机制可能在特定 T 细胞亚群中重塑染色质结构。

GIT1 位点尤其超越。GIT1 与 T 细胞功能斟酌，并在该研究中判辨最强的 CTCF 结合下落。模子研究判辨，野生型细胞在该区域形成更接近典型拓扑关结合构域（topologically associating domain， TAD）的互作模式；突变细胞中，互作更溜达。Cicero 共可及性（co-accessibility）分析也支撑类似方针：野生型细胞中的互作更明晰，而突变细胞中的模式更深广，并出现了与上游 NUFIP2 区域的新互作。CNIH2 位点也不雅察到相似局势。这里的合理推断是：IDH2 突变可能通过减轻 CTCF 范畴功能，让蓝本相对有序的调控区域变得更容易发生特别搏斗。

GATA1 的时辰问题：抒发高，不就是正在结合

临了，研究东谈主员将 D&D-seq 接入 10× Multiome，研究东谈主 CD34⁺ 造血干祖细胞向红系分化过程中 GATA1 的动态结合。施行诡秘分化第 0、5、8、18 和 24 天，同期测量转录组、染色质可及性和 GATA1-DNA 结合。

质控后，数据平均每细胞检测到 1429±1034 个基因，并得到5461±4802 个 ATAC 片断。研究东谈主员基于转录组界说了 8 类细胞气象，包括 HSC、GMP、MonoDC、BaEoMa、MEP、原红细胞（proerythroblast， Proery）、早期红系细胞和晚期红系细胞。

GATA1 结合信号主要会聚在红系分化旅途，尤其是原红细胞和早期红系细胞，而在髓系群体中基本缺失。研究东谈主员进一步界说了 48 个候选 GATA1 靶基因：这些基因位于带有 GATA1 基序和 D&D 裁剪信号的结合峰 10 kb 限度内，其中包括 SLC4A1 和 RHAG 等红细胞联系基因。

迥殊念念的是，GATA1 结合和靶基因抒发合座一致，但并作假足同步。换句话说，RNA 水平告诉咱们“废除正在发生”，D&D-seq 则让咱们看到“调控因子何时果真搏斗 DNA”。这关于涌现分化过程十分要津，因为一个转录因子的抒发量高，并不就是它在每个时刻齐占据消失批调控元件。

这项时期最值得追问的场地

D&D-seq 的兴味不在于替代 ChIP-seq、CUT&Tag 或 ATAC-seq，而在于补上一个缺口：在低输入、单细胞和多组学配景下，径直纪录特定卵白与 DNA 的搏斗。

诚然，它也有明确适度。该研究指出，D&D-seq 单细胞层面的裁剪事件数仍然较低，因此更得当伪 bulk（pseudobulk）或 metacell 团员分析，而不是对每个单细胞作念高颗粒度证明。峰强度也不可被过度解读：一个峰比另一个峰信号更高，不一定代表结合更强或更频频，因为信号还受局部染色质可及性、抗体后果、裁剪能源学和测序深度影响。更恰当的比较阵势，是比较不不异本中消失基因组位点的变化。

但这并不减轻它的价值。相悖，这些适度提醒咱们：单细胞调控组学正在从“能不可测”过问“如何正确证明”的阶段。D&D-seq 把一个永远依赖推断的问题变得更可检测：在一个复杂组织里，哪个细胞佩带突变？哪个调控卵白改变了结合？这种变化是否进一步扰动三维基因组和基因抒发？

要是说昔时咱们频频在基因抒发变化之后追问原因，那么 D&D-seq 提供了一种更聚会上游调控事件的进口。它让咱们有契机在单细胞标准上不雅察：疾病联系突变并不仅仅改变一个基因或一条通路，或然它改变的是所有这个词基因组调控空间的纠合阵势。

参考文件

Chi WY滚球(中国)app官网， Yoon SH， Goksel E， Mekerishvili L， Pelt J， Lin Y， Prieto T， Zinno J， Ganesan S， Potenski C， Izzo F， Landau DA， Raimondi I. Single-cell mapping of regulatory DNA-protein interactions. Cell. 2026 Jun 4:S0092-8674(26)00573-8. doi: 10.1016/j.cell.2026.05.014. Epub ahead of print. PMID: 42242226.